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染色体扫描电镜标本制备及观察
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一、原理
扫描电镜用于观察标本的表面形态。用戊二醛和锇酸处理的染色体标本,经单宁酸(或硫卡巴肼)还原可获得较好的导电染色效果。在扫描电镜下可观察到染色体的三维结构,也可用于常规染色体核型、G带染色体核型、高分辨染色体核型的分析及染色体结构异常识别,以弥补光镜的许多不足。在扫描电镜下还可清楚地观察到肿瘤细胞癌基因扩增结构—双微体。因而此方法广泛用于细胞生物学和遗传学的许多研究。
二、染色体标本制备的方法
1.常规染色体标本制备,同实验十。
2.取一张在光镜下观察过的染色体标本片选择分散良好的分裂相,并在背面做出标记以便电镜观察时易于寻找。
3.3:1甲醇一冰乙酸脱色,用磷酸缓冲液洗。
4.2.5%戊二醛固定30分钟。
5.0.1mol/L(pH7.4)PBS漂洗3次。
6.1%锇酸固定5分钟。
7.蒸馏水洗3次。
8.2%单宁酸处理5分钟。
9.蒸馏水洗3次。
10.1%锇酸处理lO分钟。
11.水洗3次。
12.30%→100%乙醇逐级脱水,每级5分钟。
13.临界点干燥(也可用空气干燥)。
14.把标本片标记的核型所在处用玻璃切下约5×5mm2 ,用导电胶固定在标本台上。
15.离子镀膜(也可不镀膜直接观察)。
16.扫描电镜观察、照相。
三、染色体形态观察
低倍观察可见染色体的不同分裂相,在分散较好的分裂相中,染色体呈三维立体形态。
高倍观察染色体呈长短不等的园柱状,两条单体由着丝粒相连,其表面凹凸不平,沿纵轴有许多环形沟把染色体分成许多节段。可见染色体表面由许多细纤维构成。
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